“空间定位组学”和“4D组学”建起科学研究与疾病治疗的桥梁

  LadBrokes讯 布鲁克一直以MALDI技术闻名全球,并已在成像领域占据领导地位;自去年推出timsTOF Pro创新组学系统后,在深度覆盖和高通量蛋白质组学分析中取得了突破性的进展,并且迅速和国内院校和企业开展了一系列深度的合作。比如timsTOF系列,已和北京大学、清华大学、复旦大学、厦门大学等在科研领域开展了众多深度合作,同时timsTOF系列高灵敏高通量的特点也为北京谷海天目、杭州景杰生物等第三方组学技术服务公司带来了“福音”;在质谱成像领域,从rapifleX一经推出就开始了和香港浸会大学的合作;在超高分辨MRMS上和中科院上海药物所合作等。

  今年,布鲁克结合蛋白组学和质谱成像的技术优势,重磅推出了timsTOF fleX,为空间定位组学配置了可切换的ESI和MALDI双源。ASMS会议上,LadBrokes记者采访了布鲁克•道尔顿执行副总裁Rohan Thakur博士、布鲁克•道尔顿成像/MRMS商务总监Michael Easterling博士、布鲁克•道尔顿TOF产品线经理Lucy Woods博士。他们将带我们一睹新产品的全貌,并展示其将为科学和临床研究铺就的革命性的前景之路……

布鲁克•道尔顿成像/MRMS商务总监Michael Easterling博士、LadBrokes总经理卞利萍、布鲁克•道尔顿执行副总裁Rohan Thakur博士在timsTOF fleX质谱仪前合影(从左至右)

timsTOF fleX:空间定位组学 + 4D组学

  从timsTOF Pro到timsTOF fleX,布鲁克两项重要产品的发布都同科学家紧密合作,比如:Matthias Mann、Ruedi Aebersold,Ben Collins和Hannes Roest、Jürgen Cox等;产生了PASEF(Parallel Accumulation Serial Fragmentation平行累积串行碎裂)、diaPASEF(数据非依赖采集的PASEF)、MaxQuant等合作成果。对于2017年推出的timsTOF Pro捕集离子淌度质谱已经取得了很大的成功,timsTOF Pro可以更快地进行蛋白质组学深度覆盖的研究。而如果能深入和快速的研究,就可以面对一个更广泛的临床研究的市场。临床研究面对大量的患者样本,因此速度快是必需的。皇家墨尔本医院的Andrew 教授用短柱结合timsTOF Pro做了惊人的工作:17分钟的液相梯度,平均鉴定6,600个蛋白,每天运行50个样本。日本京都大学的Yasushi教授研究药物与激酶活性,发展了1分钟梯度,每天运行864个样本的方法。这是超过我们预期的部分用户反馈。

  布鲁克在本届ASMS上推出了timsTOF fleX质谱仪,包括适配于ESI timsTOF Pro™质谱的软件可切换的MALDI源。这种新型ESI /MALDI组合功能,可在同一台质谱上实现空间定位组学SpatialOMx™。 timsTOF fleX配备布鲁克独有的10 kHz SmartBeam™ 3D激光源,具有真正的像素保真度,可在高空间分辨率下进行快速、无标记的MALDI成像,同时完全保持timsTOF Pro在ESI模式下无与伦比的4D蛋白质组学和表型组学的灵敏度。(4D指:保留时间、质荷比、离子淌度、离子强度)

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timsTOF fleX质谱仪

  diaPASEF:进一步提高30%离子利用率

  Rohan表示:timsTOF fleX 是全球第一台将组织样本分析与体液样本分析相结合的质谱仪。它的优点显而易见:许多中心实验室现在不仅可以测定组织样本,还可以做蛋白质组学,而他们不必再购买两种仪器。同时发布的另一重要产品是diaPASEF(非数据依赖采集的PASEF)。过去人们用dda(数据依赖采集)来做4D组学研究,现在增加了4D diaPASEF。利用PASEF固有的高离子利用率优势,新的diaPASEF工作流程通常可进一步提高30%离子利用率。

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diaPASEF 采集方法。a. timsTOF Pro 质谱仪的离子光学示意图。b. HeLa细胞胰蛋白酶解裂解液中多肽离子淌度和m/z的关系 c. diaPASEF,四极杆分离窗口(灰)作为离子淌度(箭头)的函数是动态定位的。在单个TIMS扫描中,选择各质量范围的离子碎裂,记录所有母离子离子淌度解析的MS2谱图。d. 用分段的四极杆分离法实施diaPASEF母离子选择 e. 用图d的母离子选择法获得的一个diaPASEF扫描样例

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不同数据采集方法的效率。a. Y6 碎片离子的提取离子流色谱图,由BSA酶解的双电荷DLGEEHFK母离子产生,对比DDA PASEF、DIA和100% 周期利用的diaPASEF方法;b. 合计的提取离子流色谱图,由一次实验中Hela酶解的多电荷母离子产生,对比DDA PASEF、DIA和25% 周期利用的diaPASEF方法

  Lucy Woods博士补充说:布鲁克和马普研究所diaPASEF的开发者们合作,用4D组学方法研究蛋白质组学和脂质组学,工作发表在biorxiv上。研究组使用超高灵敏度的方法来测定血浆等其它流体样本;建立了一个由1000多个脂质组成的碰撞截面积(CCS)数据库,人们现在可在工作流中使用此CCS数据库。“我认为该成果具有很大应用潜力,它可在脂质学工作流程上继续扩展,使得人们易于获取。”

  空间定位组学:一台仪器连接疾病和组学

  timsTOF fleX在timsTOF Pro基础上增加了MALDI功能,Rohan表示:对体液、细胞、组织的脂质组,timsTOF fleX都可以使用MALDI进行脂质分析,用timsTOF fleX一台仪器连接所有内容。

  Michael博士是空间定位组学(SpatialOMx)的主要推动和发明者之一。他补充说:今年我们推出了一个进化的产品,用布鲁克创新的timsTOF Pro,结合最先进的MALDI成像技术,使研究者可以开展深度定性的蛋白质组学研究。timsTOF Pro 同时具有4D 蛋白质组学工作流程和 MALDI 成像能力。MALDI 成像将带来什么?以前在组学和疾病间总有一道鸿沟:有些研究者做高质量的蛋白质组学和脂质组学,特别是当他们使用timsTOF Pro时。他们希望和那些疾病、癌症患者的医生交谈。但这是一个艰难的对话,因为医生读的是组织(切片)。如果你是一个习惯于整天看组织切片的人;你旁边需要有人研磨组织,然后运行LC-MS。其中总有一个断点:虽然组学获得了丰富的化学信息,但却不是在组织病理的背景下,这就是问题所在。而timsTOF fleX是一台理想的仪器,它构建了一个生态系统,把组学和疾病两个领域结合在一起。现在研究者可以真正高效地对话,可在一个平台上获得这些结果。

  布鲁克还推出许多工具来增强这些工作流的能力。比如,使用IntelliSlides (样本智能载玻片) ,非 MALDI 成像专家的实验者也可执行该工作流,消除所有的担忧,将需要启动试验的样本制备时间几乎降为零。在内部软件包(MetaboScape)中还内置了许多技能,当研究者开展4D组学实验、成像实验时,软件可以自动把这些信息链接在一起,得到关于疾病和疾病状态的上下文关联信息。

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IntelliSlides™样本智能载玻片

  在空间定位组学(SpatialOMx)中,研究者们将4D组学的深度定性和鉴定与组织形态学相结合。对于空间定位组学的一个重要发明是可使用MALDI引导的SpatialOMx方法,能够在空间上对指定的组织区域进行分析,从而允许随后的4D蛋白质组学选择性地对细胞类型的亚群进行靶向分析。当你观察疾病状态时,大部分的区域是组织微结构,所以面对一大块组织,你想要移除它的一小部分。但问题来了,到底在哪里挑选那一小块组织?虽然可以用病理学方法,但病理学方法的问题是:对疾病组织内部的检测不够灵敏。它只对一种蛋白质敏感,而一种蛋白质可能无法准确描述疾病状态,难以挑选合适的细胞来进行提取。而当你挑选提取了细胞,你还需把它们送入LC-MS运行。MALDI成像的强大之处在于:它可以无标记地对组织成像,显示所有的脂质代谢,在组织中的多肽、聚糖的分布。从这些信息中,你可以做出一个非常明智的决定:在哪里提取这些细胞,然后在LC-MS/MS上运行它们,从而获得对真正需要关注的细胞的深度识别。

  timsTOF fleX有两种空间分辨率模式,标准为20um,放大模式可达到10um。它的另一个优点是:由于采集平方像素,可以记录真实的形状,即具有真正的高像素保真度。

  当笔者追问是否有其它竞争者时,Rohan毫不犹疑地表示:“空间定位组学方面,我们没有任何其它竞争者,布鲁克正在引领该市场的发展。有些公司质谱前端采用光学显微镜观察组织,但几乎毫无用处。试想在一个没有光线黑暗的房间里,用光学技术你将无法区分任何物体。而MALDI成像采用激光的数字化成像,它自己点亮了房间里的灯,对病理切片直接成像。timsTOF fleX的软件还可以将MALDI成像处理成光学成像、病理学成像人们习惯的观察形式,完全覆盖了所有的分子学信息。”

  布鲁克是第一家从组织中提取细胞,再进行深层次蛋白质组学、代谢组学、脂质组学的公司,在此领域没有竞争者。如果你观察一个病理组织切片,但癌细胞扩散了,到底在哪里?用SpatialOMx就可以知道。

用户合作的成果

  timsTOF fleX 几个试用的客户分别来自德国、英国和澳大利亚。Michael表示:由于布鲁克是 MALDI 成像领域的领导者,该领域有许多顶级参考用户。10多组关键先锋客户已来到不莱梅工厂,他们的反馈都非常积极;其中有一些客户已深深爱上了timsTOF fleX。

  Rohan还举了一个例子,timsTOF fleX的第一个客户是一个从未做过成像但想做成像的专家,这次他在ASMS上做了演讲。因此,timsTOF fleX可以适用于那些想要做成像而从未做过的人。这次同时推出的IntelliSlides™样本智能载玻片,专门用于timsTOF fleX工作流程的自动化。借助专业软件,IntelliSlides现在可以让每个人都能轻松完成MALDI成像。Michael补充说:我们了解到有很多蛋白质组学实验室想做MALDI成像。但是购买一台用于成像的专用仪器,他们可能会觉得不值得,比如太难,学习很长时间才能开始成像实验。而timsTOF fleX无疑是一台面向实用的仪器,它让每个实验室都可以方便地开展质谱成像和组学研究。

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在timsTOF fleX上获得的大鼠脑脂质图像。20μm空间分辨率,采集5小时,包含312,095张谱图。右面板显示从 SCiLS Lab软件数据集中产生的分段分析。谱图被聚簇到对应于不同大脑区域的区

  就ASMS期间布鲁克开展的活动,Michael说:“昨天看到timsTOF fleX展示的数据表现令人印象深刻。我们的两个客户在他们的实验室安装了timsTOF fleX展示了结果,尤为引人关注,人们都在热烈讨论。今天早上的早餐会更是爆满。我们以前从未见过这样的参与热情,我想这是对timsTOF fleX取得压倒性成功的一个证明。”

质谱在个体化医疗中的作用

  在问到对精准医学的看法时,Rohan表示:更准确的说法应该是个体化医疗。精准医学是一个很模糊的词,很多人谈论它却不理解它。未来将是个体化医疗的时代,精准医学并没有什么真正的产出,而布鲁克希望通过发展技术来帮助实现个体化医疗。

  Michael补充说:对于个体化医疗来说,现在人们最感兴趣的是诸如癌症治疗的免疫疗法。免疫治疗依赖于某些突变,在二代测序方面已做了大量工作;但这些技术不能阐明后基因组的表达情况,而后基因组表达包含很多关于疾病状态的信息。这是人们真正感受到的鸿沟,现在几乎无法逾越。你可以采取比如表观遗传学的表达来分析。对于表观遗传学的表达,可以看到翻译后修饰蛋白,这是表观遗传修饰的最显著原因之一。这些修饰能反映到脂质代谢水平,比如糖在体内的代谢。timsTOF fleX能看到所有的这一切,不仅看到组学的结果,也能看到组织形态的结果。当你运行timsTOF fleX,就像用免疫法一样,你可以了解组织中感兴趣的蛋白在哪里,蛋白是活性的还是非活性的,如果是活性的它处于什么状态;还可以通过观察代谢组学来精确定量,在组学基础和组织学基础上,可以看到蛋白质活动的信息。

  谈到个体化医学,不免提到布鲁克已经通过医疗器械证的MALDI Biotyper,它可以做特定的测试(比如微生物)。但目前癌症还不能做特定的测试,还需要发现和测定那些生物标志物,timsTOF fleX目前还仅用于医学研究,但它速度很快,当验证了这些标志物,当这些测试变成常规测试,并最后通过了验证时,也许它能成为类似于MALDI Biotyper那样可用于临床诊断的仪器。

  Michael还谈到组织成像和血浆临床病理学的对比:这是正发生在全球各地的一种思想变化。血浆临床病理学已经应用了60-100年。比如人们看病时会检查血液,看不同的化学标志物是否在正常的范围内。美国的“癌症登月计划”的蓝丝带小组建议计划的第二要务是创建组织分析、3D和4D组织分析。因为现在疾病诊断只是给出在某个时间点上的快照,但人们需要了解疾病如何进展如何反应。这就需要组织分析,特别是像肿瘤在形成到转移有很多阶段,跟踪这些阶段的血液和血浆几乎是不可能的,因为一直得到相同的信息。但如果获得3D和4D的组织分析图,就不仅可以看到肿瘤的变化,还可看到它与周围细胞通信的方式。这是人类攻克癌症的未来。timsTOF fleX创立了一种新工具,将重新定义我们从组织角度思考疾病的方式。

各种质谱技术的前景

  笔者请两位比较下列各种技术和未来的前景:(1)MALDI 和 LC-MS;(2)无分离的直接电离技术;(3)质谱成像技术。Michael表示:布鲁克在上述领域都在引领市场。timsTOF的推出催化了布鲁克在市场上的表现。在科学界,MALDI和电喷雾有不同的研究者群体,但这是有问题的。因为两者有各自的优势,若将两种方法的信息结合起来,一定会得到更多的信息。布鲁克是唯一一家致力于将这两者结合起来的公司,不仅仅是把两者结合在一个平台上,还正在开发软件解决方案和其它的所有支持,这样才能充分利用LC-MS和MALDI的结合优势。

  而对于无色谱分离质谱LadBrokes网址,scimaX已经给出了最好的答案,它真正能够进行无分离的直接进样分析。目前在中国,研究者们正在运行磁共振成像质谱(MRMS)的平台。比如一些团队正在分析原油非常复杂的混合物,在非常复杂的基质中包含大量的生物分子和小分子。布鲁克已经用无分离的直接电离技术开展了一段时间,目前市场上也有一些关键的客户正在引领和推动该技术的进展。Michael表示:人们已经用这台仪器解决了许多领域独特的问题。scimaX一个最显著的特点是:它能够维持非共价键复合物的离子传输,并在后端具有超高分辨率的检测。这两个关键优势的结合非常适合药物发现。最近,我们在中科院上海药物所举办了“the State of the Art in Native Mass Spectrometry”研讨会。来自世界各地的专家来到这个研讨会,讨论了scimaX的优点,片段为基础的药物发现(Fragment-based Drug Discovery)。实验表明,scimaX保持了非常弱的非共价相互作用,可以根据感兴趣的治疗途径,筛选数千个目标物。

  对于质谱成像,布鲁克就更加自豪,因为它是第一批推出质谱成像产品的公司,从事质谱成像已有十多年。这首先和布鲁克的MALDI创新史密不可分,MALDI创新的一部分就是针对MALDI成像。在 MALDI 和 MALDI 成像方面的历史使布鲁克成为市场领导者。目前世界上所有正在做 MALDI 成像的关键参考领导者都是布鲁克的用户。而作为MALDI成像的领导者,布鲁克正在推动将MALDI成像运用到各种领域,比如支持临床研究。

  比较和另一种技术DESI的区别,Michael表示:DESI最严重的问题是重现性很差,这是技术的固有缺陷。虽然DESI可能成为科学家的“玩具”,但若想每天得到相同的图像,用DESI是不可能的。“我们有一位用户最早是DESI的拥趸,甚至被列为DESI的市场参考领导者。但他后来停止使用DESI又选择了我们的MALDI成像,因为研究生们在不停地抱怨要花好几个小时来调谐,无法得到有效的结果。停用DESI的另一个原因是无法得到重现的结果来开展临床研究。他后来飞到我们的一个用户那里用rapifleX做质谱成像,真切地体会到MALDI成像的稳定和重现性,从而改变了想法,开始用布鲁克的MALDI成像。”

  Rohan补充道:当你需要将成像应用于临床,重现性变得非常重要。你希望在系统中放置切片,按下按钮,得到结果。DESI都是手动调节,结果无法重现;而MALDI成像才能真正实现科学家们将研究用于临床的梦想。新加坡有位医生,他每天都做肝脏手术。在对癌症患者施行手术后,一个很大的问题是肿瘤有可能还在体内,得再为病人做第二次手术,这对病人是极其危险的,而用MALDI成像检查可以快速地判断,大幅降低病患的风险。

  谈到对质谱发展趋势的看法,Rohan表示:布鲁克是第一家开展单细胞工作的公司,比如伊利诺斯州厄巴纳香槟 (UIUC)的Sweedler研究组正在使用布鲁克质谱进行单细胞研究。无论是MALDI还是ESI源的质谱,未来技术发展最重要的驱动力就是灵敏度。因为研究蛋白质不能像测序或基因组学那样使用基因扩增技术。所以,未来质谱技术进步的最大挑战和驱动力就是灵敏度的提升。布鲁克未来重要的三大发展方向是:组学、制药尤其是生物制药、成像技术。这三大领域也是本届ASMS布鲁克的重点。

中国科学界采纳新技术的速度正在加快

  比较中国和欧美的市场及需求,Rohan认为他们是基本相同的,在过去的5-10年已经有了很大的改变。就目前而言,创新常发生在美国和欧洲,而很多优秀的科学家回到中国,会越来越早地使用新技术,比如,厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心是布鲁克在中国最早的timsTOF Pro的用户,清华大学化学系是最早的timsTOF用户之一。

  谈到中国客户的特点,Rohan表示:“中国是全球第二大的蛋白质组学市场,在质谱成像方面稍稍落后,我们正在努力改变这种状况。中国的科学家和全球的科学家也是一样的,科学研究的首要任务都是为本国造福;唯一的问题是如何让更多的中国科学家在世界上更早地体验和使用新技术。相对来说,在中国购买一套科学仪器设备周期比较长,这可能是导致中国科学家体验新技术比较晚的原因。从科学研究的水平来看,在ASMS海报上还可看到越来越多的中国科学家的名字。”

  Michael补充说:“我2001年初次来中国时,发现科学家们多在中国国内的期刊上交流,而现在中国有许多科学家的文章发表在Nature、Science等顶级期刊上与全球科学家交流。这是一个巨大的变化,中国已产生各领域世界级的科学领袖。我们正在努力用我们的仪器来支持中国的科学家们在各领域做出更多领导性、开创性的工作。”

布鲁克▪道尔顿储备人才提升服务

  去年开始,布鲁克▪道尔顿分出去了新的微生物的部门,谈到当前部门在中国的战略,Rohan、Michael和布鲁克▪道尔顿中国北区销售经理鲁静谈到了几点。

  从市场来讲,中国是布鲁克在亚太地区最重要的市场,也是布鲁克服务的最优先的市场。中国市场对布鲁克有非常重要的战略意义,在中国的销售业绩和增长对于布鲁克实现战略目标非常重要。对于布鲁克来说,从单个国家来说,中国每年都保持两位数增长,是全球第二大国家。

  近三年布鲁克质谱部推出大量高端产品,未来重点是在高端科研市场上。中国的售后服务和技术支持的队伍和力量都在加强。鲁静表示:“以前我们是销售驱动,产品销售了才会去培训售后服务和技术支持的人员;而现在最大的一个变化是:先进行人才技术培养和储备,然后才开始大规模的销售。售后服务的团队近年来都比较稳定,并在增加新的人手。我们送售后服务和应用支持人员到工厂培训,每人年均3次以上,这是因为相比在国内的培训,在工厂的培训会更更专业、更深入。

  中国的业务亦围绕布鲁克整体发展方向来开展。我们第一步要做的工作就是为客户做好后勤保障,售后服务和技术支持。目前,绝大多数用户对布鲁克▪道尔顿售后服务和技术支持的印象已有很大的改观,我们也收到了很多表彰。”

  参考文献:

  1.Trapped ion mobility spectrometry (TIMS) and parallel accumulation  -serial fragmentation (PASEF) enable in-depth lipidomics from minimal sample amounts. Matthias Mann等,bioRxiv preprint first posted online May. 31, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/654491

  2. Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. Ruedi Aebersold, Ben C. Collins, Hannes L. Röst, Matthias Mann等,bioRxiv preprint first posted online May. 31, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/656207

  3. MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics. Jürgen Cox等,bioRxiv preprint first posted online May. 27, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/651760

  4. Simplified high-throughput methods for deep proteome analysis on the timsTOF Pro. Andrew I Webb等,doi: https://doi.org/10.1101/657908


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